폰슈로 확인했을 때 있었으면.
항체 문제가 아닐까요?
아니면 ECL 시약이 문제일 수도 있겠네요.
1차항체는 1:1000으로
2차항체는 1:5000 rabbit으로 사용했습니다. 희석 농도를 바꾸면 나아질까요?
ecl시약은 a용액과 b용액을 1:1로 사용하였습니다.
분명히 폰슈 염색 후에는 단백질이 있는데 ecl만 찍으면 아무것도 나오지 않아 고민입니다...ㅠㅠ
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레벨5
pegasus
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14.12.12 18:35
actin 등의 항체를 붙인 후 ECL 반응해서 밴드가 나온다면,
ECL 문제는 rule out 가능할 것 같습니다.
ECL 문제가 아니라고 한다면,
희석배수를 줄이거나, 항체가 못 잡는 것이라고 볼 수도 있겠네요
트랜스퍼 후에 폰슈 염색하면 단백질이 충분히 보이는데
블로킹-워싱 5분 3번-1차항체1시간-5분 3번-2차항체1시간-5분3번 후 ECL용액 1:1비율로 뿌려 찍고 있는데 깨끗합니다..ㅠㅠ
단백질은 20마이크로넣고 있습니다.
제가 보는 인자는 inos, iL-6, 베타엑틴입니다.
1차항체 붙이는 시간을 4도에서 오버나잇하면 조금은 달라질까요?ㅠㅠ
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레벨5
pegasus
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14.12.12 21:40
흠. 웬만해선 actin이 안 나오지 않을텐데...;;;
antibody overnight시키고 다시 보셔야겠네요...
희끄무리하게라도 나오는지...
단백질 양은 충분해 보입니다.
그럼 문제는
1. 1차 항체나 2차 항체가 오래 되었다. 일반적으로 항체는 1년이상 보관 하고 사용하면 안된다고 하더군요. 오래 보관된 항체를 사용할 경우 band가 나올때도 있고 안 나올때도 있고 왔다갔다 합니다. 단, 오래 찍으면 membrane이 뿌옇게 나올 수도 있습니다.
2. 2차 항체와 1차 항체가 서로 맞지 않다. 1차 항체가 rabbit에서 분리 된 것이라면,
2차 항체는 rabbit에 반응하는 것을 사용해야 겠지요. 만약 rabbit용이 아니라
mouse나 goat 혹은 다른 용이라면 band가 전혀 나오지 않습니다.
3. 기계의 결함. 기계마다 다르겠지만 저희 랩의 경우 기계 카메라의 조리개를 최대한 열고 찍습니다. 선배분들에게 기계 다루는 것을 다시 한번 물어보세요.
위의 사항들은 가장 기본적인 문제점들입니다. 일단 확인 해보시고 문제가 없으시다면
실험 프로토콜을 점검하셔야 합니다. blocking을 할 때 사용하는 buffer는 제대로 만들었는지, 항체 희석은 어디에다가 했으며, 보관은 잘 하고 사용했는지 등등 프로토콜을 일일이 확인 하며 점검 해보세요.
western은 단백질과 단백질의 결합이기 때문에 buffer의 영향을 많이 받습니다. buffer의 조성을 잘 확인 하시고 제대로 만들어 졌는지 확인해 보시기 바랍니다.
저희 랩의 경우 skim milk를 DW에 만드는 바람에 6개월가 실험 결과가 엉망이었던적도 있습니다.
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Daegu*
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14.12.14 15:45
정말 이런 실수는 안하셨겠지요..??
membrane 상의 단백질의 위치를 잘못 자르거나 너무 타이트하게 잘라서 원하는 위치에서 안나온다던지 하는...
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ExDown's
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14.12.20 11:08
blocking solution 에 antibody넣어서 처리하시나요?
만일 TBS-T나 PBS-T 사용하시면 새로만들어보세요.
종종 기반이 잘못되서 안나오는경우도있더라구요